Рационално хранене, хранителни добавки и биостимуланти. Бюлетин на Руския държавен медицински университет — Бюлетин на Руския държавен медицински университет - архив

1 Милентиев В.Н. 2Санников Д.П. 3Казмин В.М. 2

1 Орловски държавен институт по икономика и търговия

2 Федерална държавна бюджетна институция "Център за химизация и селскостопанска радиология "Орловски"

3 Федерална държавна бюджетна образователна институция за висше професионално образование "Държавен университет - образователен, научен и индустриален комплекс"

Проучена е възможността за използване на хемилуминесценция за оценка на антиоксидантната активност на хранителните вещества. Предложеният метод се основава на хемилуминесценцията на луминол в алкална среда, чийто интензитет зависи от количеството на пероксидите в хемилуминесцентната проба. Хемилуминесценцията се записва с помощта на разработена настройка, съдържаща дозираща помпа, светлонепроницаема камера, стъклена вакуумна фотоумножителна тръба и компютърна система. За засилване на хемилуминесценцията към луминол се добавя разтвор на калиев ферицианид. Промените в интензитета на хемилуминесценция се регистрират в момента на въвеждане на анализираната проба в разтвора на луминол. Като анализирана проба се използва екстракт от глухарче, получен чрез суха нискотемпературна дестилация. Съдържа фенолни съединения, известни със своята висока антиоксидантна активност. Установено е, че хемилуминесцентният метод може да се използва за определяне на антиоксидантните свойства на различни хранителни съединения.

хемилуминесценция

антиоксидантна активност

пероксиди

хранителни вещества

1. Василиев Р.Ф. Химически блясък // Химия и химици, 21.01.10. – URL: http://chemistry-chemists.com. (дата на достъп: 22.08.13).

2. Владимиров Ю.А. Свободни радикали и антиоксиданти // Вестн. RAMN. - 1998. - бр. 7. - С. 43-51.

3. Кондрашова Е.А. Хемилуминесценцията като най-чувствителния метод за ензимен имуноанализ и неговото приложение.Клинична лабораторна диагностика. - 1999. - бр. 9. - С. 32.

4. Любимов, Г.Ю. Хемилуминесцентен анализ // Имунология. - 1991. - No 1. - С. 40–49.

5. Mayansky A.N., Nevmyatulin A.L., Chebotar I.V. Реактивна хемилуминесценция в системата на фагоцитоза // Микробиология. - 1987. - No 1. - С. 109-115.

6. Шерстнев М.П. Калций-зависими и калций-независими пътища на генериране на клетъчна хемилуминесценция.Проблеми с хемилуминесценцията. - 1991. - No 2. - С. 1–4.

Днес хемилуминесценцията е голяма област на науката, разположена на интерфейса между химия, физика и биология. По време на хемилуминесценция има директно преобразуване на химическата енергия в енергията на електромагнитните трептения, т.е. в света. С помощта на хемилуминесценция може да се научи как протича реакцията, какъв е нейният механизъм, който е необходим за ефективното и рационално провеждане на технологичните процеси. Ако технологичният процес на получаване на някакъв химичен продукт е придружен от хемилуминесценция, тогава неговият интензитет може да служи като мярка за скоростта на процеса: колкото по-бърза е реакцията, толкова по-ярко е сиянието. По време на реакцията на хемилуминесценция се получават богати на енергия продукти, които след това отделят енергия чрез излъчване на светлина, т.е. химическата енергия се превръща в енергия на електромагнитно излъчване.

Целта на изследването е да се проучи възможността за използване на хемилуминесценция за оценка на антиоксидантната активност на хранителните вещества.

Резултати от изследването и дискусия

Проблемът за оценка на антиоксидантната активност на хранителните вещества е много актуален. Използването на термина "антиоксидантна активност", за да се покаже полезността на даден продукт, често се прави без никакви химически и биохимични аргументи. Като правило антиоксидантната активност на всяко вещество означава ефективността на намаляване на пероксидната стойност. Самата концепция за пероксидната стойност също не разкрива напълно химическата му същност, тъй като не съответства напълно на кинетиката и термодинамиката на етапите на метаболизма на конкретен хранителен продукт. В допълнение, тази стойност се използва за характеризиране на липидите под формата на мазнини. Процесите на окисляване и образуване на пероксиди в организма обаче протичат не само при употребата на мазнини, но и с други продукти. С други думи, съдържанието на пероксид в конкретен продукт може да се каже, че е „претеглено“ на един вид везна, където „референтното тегло“ е единица за концентрация в кисела среда на йодиден йон, окислен от пероксиди, т.к. в резултат на което се образува молекулярен йод:

I- - e → I; (един)

I + I → I20. (2)

Когато молекулярният йод се титрува с разтвор, съдържащ натриев тиосулфат, се установява неговата концентрация и следователно се определя количеството на окислителите на йодидните йони, т.е. пероксидни съединения, което всъщност се нарича пероксидно число. Определянето на пероксидната стойност с помощта на този вид "претегляне" се основава на реакцията, показана на фиг. един.

Ориз. 1. Определяне на пероксидната стойност с помощта на натриев тиосулфат

По този начин концентрацията на пероксиди се определя от уравнението

С(I2) = ϒ(C[-O-O-]), (3)

където ϒ е коефициентът на корелация между концентрацията на молекулен йод и концентрацията на пероксиди.

Предложеният метод за определяне на пероксидите в продуктите се основава на хемилуминесценцията на луминол (C[lm]) в алкална среда, чийто интензитет (Ichl) зависи от концентрацията на пероксиди (C[-OO-]), в хемилуминесцентна проба:

МХП. = Ϧchl ω, (4)

където Ϧchl е квантовият добив на хемилуминесценция; ω - скорост на реакция, включваща пероксиди:

khlC[-O-O-] C[lm] = ω, (5)

където kchl е константата на скоростта на реакцията или при:

C[lm] kchl Ϧchl = K, (6)

IХЛ = K C[-O-O-]. (7).

Количеството пероксиди (-O-O-) се определя от светлинната сума (S):

Стойността на S зависи от степента на пълнота на консумацията на пероксид в хемилуминесцентната реакция.

За определяне на константата K се изгражда калибровъчна крива за зависимостта на светлинната сума S от концентрацията на пероксид, която се определя чрез титруване:

S = f(C[-O-O-]). (девет)

Като пероксиди се използва водороден пероксид H2O2.

След това данните, получени от уравнение (3) и (9), се сравняват. Въз основа на сравнението на ϒ и K се прави извод за координацията на реакционните механизми, които са в основата на определянето на пероксидите по тези методи. Установено е, че в този диапазон от концентрации на пероксид ϒ и K наистина се съгласуват помежду си и следователно могат да се използват за определяне на пероксидната стойност.

Хемилуминесценция се наблюдава в алкална среда, съдържаща луминол (5-амино-1,2,3,4-тетрахидро-1,4-фталазиндион, 3-аминофталов хидразид, H2L). Беше записано с помощта на хемилуминесцентна настройка, включваща стъклен вакуумен фотоумножител. Фотоумножителят се захранва от високоволтов токоизправител (7), свързан към блок (9), който усилва сигнала на фотоумножителя, който се записва на дисплея на монитора на компютъра (5).

Ориз. 2. Регистрация на хемилуминесценция на анализирания продукт: 1 - дозираща помпа; 2 - светлоустойчива камера; 3 - огледало; 4 - кювета; 5 - компютърна система; 6 - фотоумножител; 7 - токоизправител за високо напрежение; 8 - устройство, което ви позволява да определите спектралната област на хемилуминесцентното лъчение; 9 - блок за усилване на сигнала на фотоумножителя

Необходима е дозираща помпа (1) за въвеждане на анализираната проба в кювета (4), съдържаща хемилуминесцентен разтвор на луминол. Този дозатор действа като бъркалка за инжектираната проба с хемилуминесцентен разтвор. За да се подобри скоростта на реакцията и интензитета на хемилуминесценцията, към луминол се добавя разтвор на калиев ферицианид. Смесването се извършва чрез въздушни мехурчета, получени чрез изпомпване на въздух през течността от разтвора с помпа. Огледалото (3), разположено в непрозрачната камера (2), служи за по-добро светлинно събиране на хемилуминесцентното лъчение, падащо върху фотокатода на фотоумножителя (6), монтиран в непрозрачната камера. Дозаторът ви позволява да въведете желаните компоненти на течността в кюветата, без да отваряте светлонепроницаемата камера (2) по време на експериментите. В този случай тези течности влизат в кюветата (4) през стъклени или пластмасови тръби. Компютърната система ви позволява да регистрирате зависимостта на интензитета на луминесценция I от времето t, тоест кинетиката на хемилуминесценция:

Компютърната система отразява константите на възход и спад във функцията I = f(t), които са конюгирани с константите на скоростта на реакциите, които предизвикват хемилуминесценция, тоест с тяхната кинетика. В хемилуминесцентната камера е включено устройство (8), което позволява да се определи спектралната област на хемилуминесцентното лъчение, тоест зависимостта:

I = f1(λ). (единадесет)

Този блок е касета под формата на диск, в който са монтирани гранични филтри. Смяната на светлинните филтри се извършва чрез завъртане на дисковата касета около хоризонталната ос, свързваща центровете на равнината на светлинните филтри и равнината на фотокатода на фотоумножителя.

Процесът на измерване се извършва, както следва:

1. Задава се реакцията на фотоумножителя към промените в неговото захранващо напрежение и към промените в интензитета на еталонния светлинен източник, който пада върху неговия катод.

2. Кюветата се напълва с разтвор на луминол в алкална среда.

3. Дозаторът се пълни с анализираната проба.

4. Записва се зависимостта на интензитета на хемилуминесценция от времето t. Хемилуминесценцията се наблюдава до момента t1, в който промяната в I1 от момента t е минимална: I1 = f1(t).

5. Част от анализирания разтвор се подава с помощта на дозатор.

6. Наблюдава се хемилуминесценция на анализираната проба, чиято кинетика е I = f(t).

На фиг. Фигура 3 показва графика на зависимостта на функциите (I1 = f1(t)), конюгирана с графика (I = f(t)), след въвеждането на анализираното решение.

Както се вижда от фиг. 3, интензитетът на хемилуминесценцията на луминол се променя: рязко покачване е последвано от рязко намаляване на луминесценцията след добавяне на анализираната проба.

Тъй като засилването на хемилуминесценцията по време на окисляването на луминол е свързано с образуването на пероксиди, намаляването на интензивността на хемилуминесценцията след въвеждането на анализираната проба показва намаляване на техния брой. Следователно можем да говорим за наличие на антиоксидантна активност в съединенията, които съставляват анализираната проба.

Трябва да се отбележи, че като анализирана проба е използван екстрактът от глухарче, получен чрез суха нискотемпературна дестилация, който съдържа фенолни съединения, известни с високата си антиоксидантна активност.

Ориз. Фиг. 3. Графика на зависимостта на функциите (I1 = f1(t)), конюгирани с графиката (I = f(t)), след въвеждането на анализираното решение

Освен това, по време на експеримента беше установено, че с помощта на хемилуминесценция е възможно да се определи количеството пероксиди в свръхразредени системи, което е важно за оценка на началото на окисляване на продуктите, например по време на тяхното съхранение.

По този начин, проведените проучвания показват, че методът за определяне на пероксидите в продукти, базиран на хемилуминесценцията на луминол в алкална среда, дава възможност да се оцени антиоксидантната активност на хранителните вещества и може да се използва за установяване на антиоксидантните свойства на различни храни. съединения.

Рецензенти:

Литвинова Е.В., доктор на техническите науки, професор в катедра „Технология, организация и хигиена на храните“, ОрелГИЕТ, Орел;

Ковалева O.A., доктор на биологичните науки, директор на INIT, FSBEI HPE „Ориолски държавен аграрен университет“, Орел.

Работата е получена от редактора на 08 ноември 2013 г.

Библиографска връзка

Паничкин А.В., Болшакова Л.С., Милентиев В.Н., Санников Д.П., Казмин В.М. ИЗПОЛЗВАНЕ НА ХИМИЛУМИНЕСЦЕНЦИЯ ЗА ОЦЕНКА НА АНТИОКСИДАНТНИ СВОЙСТВА НА ХРАНИТЕЛНИ ВЕЩЕСТВА // Фундаментални изследвания. - 2013. - бр.10-11. – С. 2436-2439;
URL: http://fundamental-research.ru/ru/article/view?id=32810 (дата на достъп: 17.12.2019 г.). Предлагаме на вашето внимание списанията, издавани от издателство "Академия по естествена история"

теза

1.4 Методи за изследване на антиоксиданти

антиоксидантната активност се класифицират: според методите за регистриране на проявената АОА (обемна, фотометрична, хемилуминесцентна, флуоресцентна, електрохимична); по вид източник на окисление; по вид на окислено съединение; съгласно метода за измерване на окисленото съединение.

Въпреки това, най-известните методи за определяне на антиоксидантната активност са:

1 TEAC (тролокс еквивалентен антиоксидантен капацитет): методът се основава на следната реакция:

Метмиоглобин + H 2 O 2 > Ферилглобин + ABTS > ABTS * + AO.

Методът за еквивалентност на Trolox (TEAC) се основава на способността на антиоксидантите да намаляват катионите на 2,2-азинобис радикал (ABTS) и по този начин да инхибират абсорбцията в частта с дълга дължина на вълната на спектъра (600 nm). Съществен недостатък на метода е двуетапната реакция на получаване на радикал. Това удължава времето на анализа и може да увеличи разсейването на резултатите, въпреки факта, че за анализ се използва стандартизиран набор от реагенти.

2 FRAP (железо редуцираща антиоксидантна сила): методът се основава на следната реакция:

Fe(III)-трипиридилтриазин+АО>Fe(II)-трипиридилтриазин.

Желязо-редуциращ/антиоксидантен капацитет (FRAP). Тук се използва редукционната реакция на Fe(III)-трипиридилтриазин до Fe(II)-трипиридилтриазин. Този метод обаче не може да определи някои антиоксиданти, като глутатион. Този метод позволява директно определяне на антиоксиданти с ниско молекулно тегло. При ниско рН, редукцията на Fe(III) трипиридилтриазиновия комплекс до Fe(II) комплекса е придружена от появата на интензивен син цвят. Измерванията се основават на способността на антиоксидантите да потискат окислителния ефект на реакционните частици, генерирани в реакционната смес. Този метод е прост, бърз и евтин в изпълнение.

3 ORAC (капацитет на абсорбция на кислородни радикали): методът се основава на следната реакция:

Fe (II) + H 2 O 2 > Fe (III) + OH * + AO> OH * + Luminol.

Определяне на способността за абсорбиране на кислородни радикали (ORAC). При този метод се записва флуоресценцията на субстрата (фикоеритрин или флуоресцеин), което възниква в резултат на взаимодействието му с ROS. Ако в тестовата проба има антиоксиданти, тогава се наблюдава намаляване на флуоресценцията в сравнение с контролната проба. Този метод първоначално е разработен от д-р Гуохуа Цао в Националния институт по стареене през 1992 г. През 1996 г. д-р Као се присъедини към д-р Роналд Прайър в съвместна група в Изследователския център за стареене на USDA, където беше полуавтоматичен метод разработени.

4 TRAP (параметър на антиоксидант за улавяне на общия радикал): методът се основава на следната реакция:

AAPH+AO>AAPH* + PL (PE).

Този метод използва способността на антиоксидантите да взаимодействат с пероксилния радикал 2,2-азобис(2-амидинопропан) дихидрохлорид (AAPH). TRAP модификациите се състоят в методи за регистриране на аналитичен сигнал. Най-често, на последния етап на анализа, AAPH перокси радикалът взаимодейства с луминесцентен (луминол), флуоресцентен (дихлорофлуоресцин диацетат, DCFH-DA) или друг оптично активен субстрат.

Водоразтворимото производно на витамин Е Trolox (6-хидрокси-2,5,7,8-тетраметилхроман-2-карбокси киселина) се използва като стандарт за методите TEAC, ORAC и TRAP.

Напоследък се засили интересът към използването на електрохимични методи за оценка на антиоксидантната активност. Тези методи са много чувствителен и бърз анализ.

Оценката на антиоксидантната активност на някои хранителни продукти се извършва чрез потенциометричния метод, базиран на използването на свойството на антиоксидантните вещества да участват в редокс реакции, дължащи се на енол (-OH) и сулфхидрил (-SH) групи.

Определянето на антиоксидантните свойства на разтворите се основава на химичното взаимодействие на антиоксидантите с медиаторната система, което води до промяна в нейния редокс потенциал. Електрохимичната клетка е контейнер, съдържащ K-Na-фосфатен буферен разтвор, медиаторна система Fe(III)/Fe(II) и сложен електрод преди измерване на редокс потенциала. Антиоксидантната активност се оценява в g-eq/l.

Амперометричният метод за определяне на антиоксидантната активност се основава на измерване на електрическия ток, който възниква при окисляването на изпитваното вещество върху повърхността на работния електрод, която е под определен потенциал. Чувствителността на амперометричния метод се определя както от естеството на работния електрод, така и от приложения към него потенциал. Границата на откриване на амперометричния детектор на полифеноли, флавоноиди е на ниво нано-пикограми, при такива ниски концентрации има по-ниска вероятност за взаимно влияние на различни антиоксиданти в тяхното съвместно присъствие, по-специално проява на феномена синергизъм . Недостатъците на метода включват неговата специфичност: при тези условия антиоксидантите, които сами по себе си се окисляват или редуцират в областта на кислородните електроредукционни потенциали, не могат да бъдат анализирани. Предимствата на метода включват неговата бързина, простата и чувствителност.

Метод на галваностатична кулометрия с използване на електрогенерирани оксиданти - методът е приложим за анализ на мастноразтворими антиоксиданти.

Разработени са различни методи за определяне на аскорбинова киселина:

амперометричен метод, използващ алуминиев електрод, модифициран с филм от никел(II) хексацианоферат чрез прост метод на потапяне в разтвор;

метод за спектрофотометрично и визуално определяне на аскорбинова киселина в твърда фаза, използвайки ксерогел от силициева киселина, модифициран с реактива на Wawel и мед (II) като индикаторен прах;

хемилуминесцентното определяне на аскорбинова киселина може да се извърши чрез метода на инжектиране на поток съгласно хемилуминесцентната реакция на родамин В с церий (IV) в среда със сярна киселина.

определяне на аскорбинова киселина в диапазона 10 -8 -10 -3 g/cm 3 чрез анодна волтаметрия във водна и водно-органична среда.

Най-разпространеният е методът FRAP, тъй като е експресен, силно чувствителен. През последните няколко десетилетия са разработени голям брой разновидности на методи за определяне на антиоксидантната активност по метода FRAP (таблица 1).

Таблица 1 Развитие на метода FRAP и неговото приложение за определяне на антиоксидантната активност на различни обекти

	Обекти на анализ	Бележки
	кръвна плазма	t=4мин. Изследвани са реакционната стехиометрия и адитивността.
	Чай, вино	Определяне на AOA поради полифеноли
		Сравняват се стойностите на AOA на различните видове чай
Пулидо, Браво, Саура-Каликсто	Моделни решения	t=30 мин. Установено е влиянието на неводния разтворител
	Растения
	кръв, тъкан	PIA метод. Проверено е влиянието на чужди вещества.
Фирузи, Лакана, Петручи e.a.	Моделни решения	Изследвана е чувствителността на определяне на различни АО като функция от тяхната структура и редокс потенциал.
Каталинич, Милош,	Различни вина
Темердашев, Цюпко и др.	Моделни смеси
Логинова, Коновалова	Лекарства. Препарати	метод на тестване
Темердашев, Цюпко и др.	Червени сухи вина	Съотношение на AOA с други показатели за качество на виното
Таблица 1 продължава
	Моделни смеси	Чувствителността на определянето на различни АО
Вершинин, Власова, Цюпко	Моделни смеси	Установена е неаддитивността на сигнала с липса на окислител
Анисимович, Дейнека и др.	Моделни решения	Предложени са кинетични параметри за оценка на AOA.

Бележки: конвенционално маркирани: PIA-flow-инжекционен анализ, TPTZ-трипиридилтриазин, DIP-2,2, -дипиридил, PHEN-o-фенантролин, DPA-пиридиндикарбоксилна киселина, FZ-ферозин, AA-аскорбинова киселина, CT-катехол, t - време на експозиция, мин.

Взаимодействие между протеини и полиелектролити във водни разтвори

За характеризиране на протеин-полиелектролитни комплекси се използват различни методи за анализ. Инструменталните методи предоставят информация за структурните и оптичните свойства, както и определят динамиката и естеството на PEC свързването...

Ефект на d-метални съединения върху скоростта на дисоциация на водна молекула в биполярна мембрана

В процеса на синтезиране на нови BPM трябва да се обърне голямо внимание на изследването на свойствата на получените проби за последващ избор на условия на синтез, които осигуряват подобряване на електрохимичните характеристики на синтезираните мембрани...

Дизайнерски лекарства и синтетични канабиноиди

Откриването на синтетични канабиноиди в билкови смеси може да се извърши чрез различни физикохимични методи, като газова хроматография-масспектрометрия, газова, тънкослойна и високоефективна течна хроматография...

Разработване на метод за определяне на флавоноиди в лечебните растителни материали

Синтез и фармакологични свойства на хинолинони-2

Обект на изследване: Хинолинон-2. Метод на изследване: С помощта на компютърната програма "Marvin JS" е създадена структурата на веществото. След това тя беше изпратена на сайта "http://www.way2drug.com/PASSOnline/predict.php" за по-нататъшно разследване...

Термоспектрален метод за изследване на продуктите от изпаряване на епоксиден полимер

Технология за получаване на високо пречистен хитозан от черупки на ракообразни

Определяне на молекулното тегло на хитозана Молекулното тегло на хитозана се определя вискозиметрично съгласно стандартния метод. Приготвят се разтвори с концентрация 0,05 и 0,5 g/dl чрез разтваряне на претеглена част от полимерния прах в ацетатен буфер (0...

Физико-географска характеристика на територията на природния парк

Ключови думи

свободен радикал/антиоксидант/ антиоксидантна активност / общ антиоксидантен капацитет / хемилуминесценция/ луминол / свободен радикал / антиоксидант / антиоксидантна активност / общ антиоксидантен капацитет / хемилуминесценция / луминол

анотация научна статия по химични науки, автор на научна статия - Георги Константинович Владимиров, Е. В. Сергунова, Д. Ю. Измайлов, Ю. А. Владимиров

Лечебните растителни материали са един от източниците на антиоксиданти за човешкото тяло. Сред методите за определяне съдържанието на антиоксиданти в растителните обекти е широко разпространен методът на хемилуминесцентен анализ. В настоящата работа той беше използван за оценка общ антиоксидантен капацитет(OAU) отвари от плодове на офика, дива роза и глог и запарка от плодове на малина. Кинетиката е записана в експеримента хемилуминесценцияв система, състояща се от пероксидаза от хрян, водороден прекис и луминол. Концентрациите и обемите на компонентите на системата в пробата са избрани така, че силните антиоксиданти (аскорбинова киселина) и умерено силните антиоксиданти (кверцетин) да бъдат напълно окислени по време на времето за измерване (10 минути). Предложен е и обоснован метод за изчисляване на TAU въз основа на промяна в светлинната сума. хемилуминесценцияв присъствието на растителни проби. Кинетичен анализ хемилуминесценцияпоказа, че в изследваните обекти преобладават антиоксиданти със средна сила, включително флавоноиди, и слаби антиоксиданти (токоферол и др.). Сравнението на изчислените стойности на TAU за изследваните обекти и данните от техния химичен анализ показа, че продуктите, съдържащи едно и също количество антиоксиданти с различни съотношения по видове, могат да се различават по способността си да предпазват организма от вредното въздействие на свободните радикали. Описаната техника е обещаваща за изследване на растителни обекти, съдържащи смес от различни видове антиоксиданти.

Свързани теми научни трудове по химични науки, автор на научна статия - Георги Константинович Владимиров, Е. В. Сергунова, Д. Ю. Измайлов, Ю. А. Владимиров

2016 г. / Георгий Владимиров, Сергунова Е.В., Измайлов Д.Ю., Владимиров Ю.А.
Определяне на антиоксиданти чрез активирана хемилуминесценция с помощта на 2,2"-азо-бис(2-амидинопропан)
2012 / Алексеев А.В., Проскурнина Е.В., Владимиров Ю.А.
Антиоксидантно действие на дихидрокверцетин и рутин в реакции на пероксидаза, катализирани от цитохром с
2008 г. / Демин Е.М., Проскурнина Е.В., Владимиров Ю.А.
Оценка на окислителния и антиоксидантния капацитет на биологичните субстрати чрез хемилуминесценция, индуцирана от реакцията на Фентън
2016 / Пискарев Игор Михайлович, I.P. Иванова
Определяне на съдържанието на липохидропероксиди в липопротеините на кръвния серум с помощта на системата микропероксидаза-луминол
2011 / Теселкин Юрий Олегович, Бабенкова Ирина Владимировна
Методи за изследване на антиоксидантите
2004 / Хасанов В. В., Рижова Г. Л., Малцева Е. В.
Антиоксидантна активност на растенията, използвани в етномедицината на Тува
2012 / Чехани Н.Р., Теселкин Ю.О., Павлова Л.А., Козин С.В., Любицки О.Б.
Изследване на антиоксидантните свойства на Фоспренил в различни биологични тестови системи
2017 / А. В. Санин, А. Н. Наровлянски, А. В. Пронин, Т. Н. Кожевникова, В. Ю. Санина, А. Д. Агафонова
Влияние на различни дози полихлорирани бифенили върху състоянието на спонтанна и имуноглобулин-индуцирана луминол-зависима хемилуминесценция на цяла кръв
2016 / Габдулхакова И.Р., Каюмова А.Ф., Самоходова О.В.
Оценка на липидната пероксидационна система за антиоксидантна защита при деца с есенциална артериална хипертония чрез спектрофотометрия и хемилуминесцентни методи
2014 / Натяганова Лариса Викторовна, Гаврилова Оксана Александровна, Колесникова Лариса Романовна

Хемилуминесцентно определяне на общия антиоксидантен капацитет в лечебния растителен материал

Лечебният растителен материал е един от източниците на антиоксиданти за човешкото тяло. Хемилуминесцентният анализ е един от често срещаните методи за определяне на съдържанието на антиоксиданти в растителните материали. В нашата работа беше използван хемилуминесцентен анализ за определяне на общия антиоксидантен капацитет (TAC) на плодови отвари от планинска пепел, роза и глог, както и запарка от плодове от малина. Експериментите установяват кинетиката на хемилуминесценцията на система, състояща се от пероксидаза от хрян, водороден прекис и луминол. Концентрациите и обемите на компонентите на системата са избрани така, че силните антиоксиданти (аскорбинова киселина) и антиоксидантите със средна сила (кверцетин) да бъдат напълно окислени по време на измерването (10 минути). Предложен и обоснован е метод за изчисляване на TAC, базиран на промени в хемилуминесцентната светлинна сума в присъствието на растителни проби. Анализът на кинетиката на хемилуминесценцията показа, че в изследваните обекти доминират антиоксиданти със средна сила, включително флавоноиди и слаби антиоксиданти (токоферол и други). Сравнението на изчислените стойности на TAC за изследваните обекти и данните от техния химичен анализ показа, че продуктите, съдържащи едно и също количество антиоксиданти с различни съотношения на антиоксиданти по видове, могат да се различават по способността си да предпазват тялото от вредното въздействие на свободните радикали . Описаната техника е обещаваща за изследване на растителни обекти, съдържащи смес от различни видове антиоксиданти.

Текстът на научния труд на тема "Хемилуминесцентен метод за определяне на общия антиоксидантен капацитет в лечебните растителни материали"

хемилуминесцентен метод за определяне на общия антиоксидантен капацитет в лечебните растителни материали

Г. К. Владимиров1^, Е. В. Сергунова2, Д. Ю. Измайлов1, Ю. А. Владимиров1

1 Катедра по медицинска биофизика, Факултет по фундаментална медицина, Московски държавен университет Ломоносов, Москва

2 Катедра по фармакогнозия, Фармацевтичен факултет,

I. M. Sechenov Първи Московски държавен медицински университет, Москва

Лечебните растителни материали са един от източниците на антиоксиданти за човешкото тяло. Сред методите за определяне съдържанието на антиоксиданти в растителните обекти е широко разпространен методът на хемилуминесцентен анализ. В настоящата работа той е използван за оценка на общия антиоксидантен капацитет (TOA) на отвари от плодове от офика, дива роза и глог и запарка от плодове от малина. В експеримента кинетиката на хемилуминесценцията е записана в система, състояща се от пероксидаза от хрян, водороден пероксид и луминол. Концентрациите и обемите на компонентите на системата в пробата са избрани така, че силните антиоксиданти (аскорбинова киселина) и умерено силните антиоксиданти (кверцетин) да бъдат напълно окислени по време на времето за измерване (10 минути). Предложен е и обоснован метод за изчисляване на RAE въз основа на изменението на хемилуминесцентната светлинна сума в присъствието на растителни проби. Анализът на кинетиката на хемилуминесценцията показа, че сред изследваните обекти преобладават умерено силни антиоксиданти, включително флавоноиди, и слаби антиоксиданти (токоферол и др.). Сравнението на изчислените стойности на TAU за изследваните обекти и данните от техния химичен анализ показа, че продуктите, съдържащи едно и също количество антиоксиданти с различни съотношения по видове, могат да се различават по способността си да предпазват организма от вредното въздействие на свободните радикали. Описаната техника е обещаваща за изследване на растителни обекти, съдържащи смес от различни видове антиоксиданти.

Ключови думи: свободен радикал, антиоксидант, антиоксидантна активност, общ антиоксидантен капацитет, хемилуминесценция, луминол

Финансиране: Тази работа е подкрепена от Руската научна фондация, грант № 14-15-00375.

Пр.3 Кореспонденция трябва да бъде адресирана: Георги Константинович Владимиров

119192, Москва, Ломоносовски пр-т, 31, сграда 5; [защитен с имейл]

Статията получена: 10.03.2016 Статия приета за публикуване: 18.03.2016

хемилуминесцентно определяне на общия антиоксидантен капацитет в лечебния растителен материал

1 Катедра по медицинска биофизика, Факултет по фундаментална медицина, Московски държавен университет Ломоносов, Москва, Русия

2 Катедра по фармакогнозия, Фармацевтичен факултет,

Първият Московски държавен медицински университет Сеченов, Москва, Русия

Финансиране: тази работа е подкрепена от Руската научна фондация, грант №. 14-15-00375.

Благодарности: авторите благодарят на Андрей Алексеев от Московския държавен университет „Ломоносов“ за помощта му при провеждането на експеримента. Кореспонденцията трябва да бъде адресирана: Георги Владимиров

Ломоносовски проспект, д. 31, к. 5, Москва, Русия, 119192; [защитен с имейл]Получено: 10.03.2016 г. Прието: 18.03.2016 г.

Свободните радикали, генерирани в тялото, нарушават структурата на клетъчните мембрани, което от своя страна води до развитието на различни патологични състояния. Разрушителният оксидативен ефект на радикалите се предотвратява от антиоксидантната защитна система на организма, в която важна роля играят съединения с ниско молекулно тегло – радикални ловци (капани). Един от източниците на антиоксиданти са лечебните растителни суровини, както и препарати на тяхна основа, изучаването на антиоксидантния потенциал на които спомага за повишаване на техния превантивен и терапевтичен ефект.

Основните методи за определяне на антиоксидантите са разгледани в произведенията, но дефиницията на антиоксидантите като химични съединения не дава пълна картина на защитните свойства на изследвания обект: те се определят не само от количеството на един или друг антиоксидант , но и от дейността на всеки един от тях. Антиоксидантната активност или антиоксидантната активност, AOA, е скоростната константа за реакцията на антиоксидант със свободен радикал (kInH). Методът на хемилуминесценция (CL) дава възможност да се определи общото количество радикали, които антиоксидантите свързват в пробата (общ антиоксидантен капацитет, TAU), а при използване на метода за математическо моделиране на кинетиката на CL, също скоростта на образуване и реакция на радикали с антиоксиданти, т.е. AOA.

Най-често срещаната модификация на хемилуминесцентния метод за определяне на общия антиоксидантен капацитет се основава на използването на луминол като хемилуминесцентен активатор. В кюветата на хемилуминометъра се поставя проба с добавяне на луминол, водороден прекис и съединение, способно да генерира радикали в резултат на спонтанно разлагане (термолиза), например 2,2"-азобис-(2-амидинопропан) ) дихидрохлорид (ABAP):

В присъствието на молекулен кислород, алкиловият радикал R^ образува пероксилов радикал ROO^:

ROO^ + LH2 ^ ROOH + LHv От LH, чрез образуването на междинни вещества (луминол хидропероксид и луминол ендопероксид), в електронно възбудено състояние се образува молекула на крайния продукт на окисление на луминол, аминофталова киселина, която излъчва фотон и в резултат на това се наблюдава хемилуминесценция. Интензитетът на CL е пропорционален на скоростта на производство на фотони, която от своя страна е пропорционална на стационарната концентрация на LH в системата. Взаимодействайки с радикалите, антиоксидантите прекъсват описаната верига от трансформации и предотвратяват образуването на фотон.

Съединенията, подложени на термолиза, не са единственият възможен източник на радикали при анализа на антиоксидантния капацитет на пробата по хемилуминесцентния метод. Алтернативи са пероксидаза от хрян-водороден пероксид, хемин-водороден пероксид, цитохром с-кардиолипин-водороден пероксид и др. Схемата на реакциите на окисление на луминол от пероксидази е разгледана в работата на Cormier et al. .

Кинетичните криви на CL за тези системи отразяват два етапа на реакцията: етапа на увеличаване на интензитета на CL и етапа на плато или постепенно намаляване на луминесценцията, когато

Интензитетът на CL е или постоянен, или бавно намалява. Документът описва два подхода за измерване на общия антиоксидантен капацитет, които отчитат тази характеристика на кривите. Методът TRAP (общ реактивен антиоксидантен потенциал) се основава на измерване на латентността на CL t и може да се използва за определяне на антиоксиданти като тролокс или аскорбинова киселина: те се характеризират с висока константа на скоростта на реакция с радикали и поради тази причина могат да бъдат наречени силни антиоксиданти.. През латентния период настъпва пълното им окисляване. Методът TAR (Обща антиоксидантна реактивност) измерва степента на потушаване на хемилуминесценцията q на платото или в максимума на кривата на хемилуминесценция:

където I е интензитетът на хемилуминесценция без антиоксидант, а 11 е интензитетът на CL в присъствието на антиоксидант. Този метод се използва, ако системата съдържа предимно слаби антиоксиданти с ниски скоростни константи на взаимодействие с радикали - много по-ниски в сравнение с луминоловата константа.

Действието на антиоксидантите се характеризира не само с показатели на t и c. Както се вижда от произведенията, действието на антиоксиданти като пикочна киселина в системата хемин-H202-луминол или токоферол, рутин и кверцетин в системата цитохром c-кардиолипин-H202-луминол се характеризира с промяна в максималната скорост на покачване на CL (utx). Както показват резултатите от математическото моделиране на кинетиката, стойностите на константите на скоростта на взаимодействието на тези антиоксиданти с радикали са близки до стойността на луминоловата константа, следователно такива антиоксиданти могат да се нарекат антиоксиданти със средна сила.

Ако изследваният материал, по-специално растителните суровини, съдържаше само един вид антиоксиданти, тогава тяхното съдържание може да се характеризира с един от трите индикатора, изброени по-горе (m, q или V). Но растителните суровини съдържат смес от антиоксиданти с различна сила. За да решат този проблем, някои автори са използвали промяната в хемилуминесцентната светлинна сума за определено време DE, изчислена по формулата

DE = DE0 - DE,

където DE0 и DE5 са CL светлинни суми за дадено време? в контролните и тестовите проби, съответно. Времето трябва да е достатъчно за окисляването на всички антиоксиданти в системата, т.е. кривата CL на изпитваната проба да достигне нивото на кривата CL на контролната проба. Последното предполага, че изследователите трябва не само да записват светлинната сума на луминесценцията, но и да записват кинетичната крива на CL за достатъчно дълго време, което не винаги се прави.

Тъй като всички измерени показатели зависят от инструмента и условията на измерване, антиоксидантният ефект на дадено вещество в изследваната система обикновено се сравнява с ефекта на антиоксидант, взет като стандарт, като Trolox.

Системата хрянова пероксидаза-водороден пероксид е използвана за анализ на общия антиоксидантен капацитет на растителните материали от много автори. В работата за оценка на количеството антиоксиданти в пробите е използван латентен период на CL (метод TRAP), а в работата е използвана площта под кривата на развитие на CL. Тези произведения обаче не дават ясна обосновка

изборът на един или друг параметър за оценка на OAU.

Целта на изследването е да се определи как съотношението на антиоксидантите от различни видове влияе върху TAU и да се модифицира хемилуминесцентният метод по такъв начин, че да може по-точно да се определи TAU в растителните материали. За да направим това, ние сме си поставили няколко задачи. Първо, да се сравни кинетиката на CL на изследваните обекти с кинетиката на стандартните антиоксиданти от три типа (силни, средни и слаби), за да се разбере кой тип антиоксиданти има основния принос за TAE на изследваните обекти. Второ, да се изчисли TAE на изследваните обекти чрез измерване на намаляването на светлинната сума на CL под действието на тези обекти в сравнение с действието на антиоксиданта, който осигурява най-голям принос за TAE.

МАТЕРИАЛИ И МЕТОДИ

Обект на изследване са промишлени проби от плодове от глог, планинска пепел и дива роза, произведени от Красногорсклексредства АД (Русия), както и плодове от малини, събрани от авторите в Московска област при естествени условия на отглеждане и сушени при температура 60- 80 ° C, докато спрат да изолират сок и деформации на налягането.

Реагентите за анализ на антиоксидантния капацитет по хемилуминесцентен метод са: KH2PO4, 20 mM буферен разтвор (рН 7,4); пероксидаза от корени на хрян (активност 112 U/mg, M = 44 173.9), 1 mM воден разтвор; луминол (5-амино-1,2,3,4-тетрахидро-1,4-фталазиндион, хидразид на 3-аминофталова киселина, М=177,11), 1 mM воден разтвор; водороден пероксид (H2O2, М = 34,01), 1 mM воден разтвор; разтвори на антиоксиданти (аскорбинова киселина, кверцетин, токоферол). Всички реагенти са произведени от Sigma Aldrich (САЩ).

Отвари от глог, планинска пепел и плодове от дива роза и запарка от плодове на малина се приготвят по методиката на Държавната фармакопея на СССР, изложена в общата фармакопейна статия „Настойки и отвари“.

Общият антиоксидантен капацитет се определя чрез записване на хемилуминесценция на хемилуминометър Lum-100 (DISoft, Русия) с помощта на софтуер PowerGraph 3.3. За определяне на TAU в растителни материали, 40 µl луминол при концентрация 1 mM, 40 µl пероксидаза от хрян при концентрация 0,1 µM, от 10 до 50 µl отвара или инфузия (в зависимост от концентрацията) и фосфатен буфер в количеството, необходимо за довеждане на общия обем на пробата до 1 ml. Кюветата беше инсталирана в устройството и CL беше записан, като се наблюдава фоновият сигнал. След 48 s регистрация на фоновия сигнал, 100 μl H2O2 в концентрация от 1 mM се добавят към кюветата и регистрацията на CL продължава 10 минути. Бяха приготвени четири проби с различни концентрации на всеки от растителните обекти. CL също е регистриран за разтвори на аскорбинова киселина, кверцетин и токоферол в пет различни концентрации за всеки от антиоксидантите. Впоследствие TAU на пробите от отвари и настойки се преизчислява за кверцетин.

Концентрациите на луминол, хрянова пероксидаза и водороден прекис са подбрани така, че да се определи антиоксидантната способност на водните екстракти от лечебни растителни материали за разумно време (не повече от 10 минути). През това време кривите на хемилуминесценция за антиоксидантите аскорбат и флавоноида кверцетин (основните антиоксиданти на растителните материали)

достигна плато, което показва пълното унищожаване на антиоксидантите в системата. Разрежданията на изследваните проби и концентрациите на разтвори на стандартни антиоксиданти (посочени в надписите към фигурите) са избрани по такъв начин, че всички CL кинетични криви да бъдат измерени при една и съща чувствителност на инструмента.

Антиоксидантният капацитет се изчислява от промяната в площта (AS) под хемилуминесцентната кинетична крива (светлинна сума) при добавяне на вещество, съдържащо антиоксидант. За да направим това, изчислихме S0 за системата без антиоксидант и извадихме от нея площта SS, която характеризира системата, към която е добавен антиоксидантът. Стойността на AS зависи от чувствителността на хемилуминометъра и условията на измерване. Съотношението AS/C ■ V (където C е концентрацията на изследвания биологичен материал в кюветата, g/l, а V е обемът на кюветата, l) изразява антиоксидантния капацитет на 1 g от изследвания материал, т.е. , растителен материал.

Антиоксидантният капацитет ASa на разтвор на стандартен антиоксидант, например кверцетин, поставен в същия обем на реакционната смес, се изчислява по подобен начин. Съотношението AS/CÄ ■ V (където CA е тегловната концентрация на антиоксиданта в кюветата, g/l) изразява антиоксидантния капацитет на 1 g от антиоксиданта.

За всеки от стандартните антиоксиданти се записва сигналът от разтвори с няколко концентрации, за да се гарантира, че изчисленията са извършени в границите на линейна зависимост и получените резултати са възпроизводими. Действително се получава линейна зависимост (ASa = kA ■ CA) на сигнала от концентрацията, от която се изчислява стехиометричният коефициент kA. Според критерия на Фишер, получените стойности на kA за стандартните антиоксиданти са статистически значими с вероятност 0,975. След това се записва сигналът от четири концентрации за всяка от четирите растителни проби и за всички проби се получава линейна зависимост на сигнала от концентрацията (AS = k ■ C), от която се изчислява стехиометричният коефициент k. С вероятност от 0,975 (тест на Фишер), получените k стойности за растителни проби са статистически значими. Общият антиоксидантен капацитет на растителния материал по отношение на теглото на стандартния антиоксидант (mg%) се установява по формулата

OAU = k ■ 105. k

Стойностите бяха представени като средноаритметично ± стандартно отклонение (M ± 5) при p<0,05.

РЕЗУЛТАТИ ОТ ИЗСЛЕДВАНЕТО

Изследването на кинетиката на хемилуминесценцията в присъствието на натриев аскорбат (фиг. 1) показа, че този антиоксидант се характеризира с латентен период, когато CL е почти напълно потиснат. Продължителността му е пропорционална на количеството антиоксидант в системата. В този случай не се променят нито наклонът на CL кривите, нито интензитетът на CL на платото. Това се обяснява с факта, че аскорбиновата киселина е силен антиоксидант, който улавя всички радикали, образувани в системата, включително луминоловите радикали, и CL не се развива, докато целият аскорбат не се окисли.

Действието на токоферола (фиг. 2) се проявява чрез намаляване на интензитета на CL на плато, което е типично за слабите антиоксиданти, въпреки че токоферолът се счита за един от най-

мощни антиоксиданти. Може би това несъответствие се дължи на факта, че в нашия експеримент свободните радикали са били във воден разтвор, докато ефектът на токоферола обикновено се изследва в неполярна среда. В работата, където комплексът от цитохром с с кардиолипин служи като източник на радикали и реакцията с луминол протича в рамките на този комплекс, токоферолът притежава свойствата на антиоксидант със средна сила.

След като изследвахме ефекта на различни концентрации на кверцетин върху нашата система (фиг. 3) и сравнявайки кинетичните криви за него и натриевия аскорбат и токоферол, може да се отбележи, че основният ефект на кверцетин се проявява в промяна в наклона на криви, т.е. скоростта на развитие на CL, която е типична за умерените антиоксиданти.

Кривите на CL за всички изследвани отвари (фиг. 4) наподобяват кривите за кверцетин с леко намаляване на интензитета на CL в края, т.е.

Време, мин

Ориз. 1. Ефект на натриевия аскорбат върху кинетиката на хемилуминесценция

Концентрациите на компонентите на системата: луминол - 40 μM, пероксидаза от хрян - 4 nM, водороден прекис - 100 μM. Криви: 1 - контролна проба; 2 - 0,05 µM; 3 - 0,10 µM; 4 - 0,15 µM; 5 - 0,2 µM; 6 - 0,25 μM натриев аскорбат.

плато. Както е показано в работата, това поведение е типично за антиоксиданти със средна сила, които в нашия случай включват полифеноли - флавоноиди и танини. За инфузия на малинови плодове (фиг. 4, D) се забелязва намаляване на хемилуминесценцията на ниво плато, което е характерно за слабите антиоксиданти, което в случая е токоферол. По отношение на кверцетин и токоферол, инфузия на плодове от малина съдържа 4,7 ± 0,9 µmol/g кверцетин и 11,9 ± 0,8 µmol/g токоферол.

При сравняване на кривите на хемилуминесценция, получени за различни концентрации на четирите изследвани водни екстракта от растителни материали, беше показано, че приносът на средни и слаби антиоксиданти към общия антиоксидантен капацитет на пробите намалява в следния ред: инфузия на плодове от малина (фиг. 4, Г), отвара от плодове от шипка (фиг. 4, В), отвара от плодове на офика (фиг. 4, А), отвара от плодове от глог (фиг. 4, Б). Стойностите на AS по отношение на концентрацията C на изследваното вещество в кюветата и стойностите на общия антиоксидантен капацитет по отношение на кверцетин са показани в таблицата.

ОБИСВАНЕТО НА РЕЗУЛТАТИТЕ

Получените по време на експериментите данни и изчислените въз основа на тях стойности на TAU на изследваните обекти бяха сравнени със съдържанието на основните антиоксиданти в тях, определено с помощта на химични методи за анализ. Въпреки факта, че положителната корелация между общото количество антиоксиданти и TAU в различни обекти е неоспорима, има забележими разлики между тези показатели. Например, ако вземем сумата от съдържанието на флавоноиди, танини и аскорбинова киселина, тогава тя се оказва повече от изчисления TAU за всички изследвани обекти, с изключение на отварата от плодовете на глог (таблица).

Други изследователи също показват, че резултатите от химическия анализ и стойността на TAU, определена чрез хемилуминесцентния метод, често не съвпадат. В работата се определя общият антиоксидантен капацитет

46 Време, мин

Аз" "х чи----.

Ориз. 2. Ефект на токоферол върху кинетиката на хемилуминесценция

Концентрациите на компонентите на системата: луминол - 40 μM, пероксидаза от хрян - 4 nM, водороден прекис - 100 μM. Криви: 1 - контролна проба; 2 - 0,01 µM; 3 - 0,025 µM; 4 - 0,06 µM; 5 - 0,1 µM; 6 - 0,2 μM токоферол.

46 Време, мин

Ориз. Фиг. 3. Ефект на кверцетин върху кинетиката на хемилуминесценция. Концентрации на компонентите на системата: луминол - 40 μM, пероксидаза от хрян - 4 nM, водороден прекис - 100 μM. Криви: 1 - контролна проба; 2 - 0,02 µM; 3 - 0,03 µM; 4 - 0,04 µM; 5 - 0,05 µM; 6 - 0,06 μM кверцетин.

Време, мин

46 Време, мин

120 I 100 80 \ 60 40 20

46 Време, мин

Ориз. Фиг. 4. Влияние на отвари от плодове на офика (А), глог (Б), дива роза (В) и запарка от малини (Г) върху кинетиката на хемилуминесценция. (А) Криви: 1 - контролна проба; 2 - 0,002 g/l; 3 - 0,004 g/l; 4 - 0,006 g/l; 5 - 0,008 г/л отвара от плодове на офика. (B) Криви: 1 - контролна проба; 2 - 0,005 g/l; 3 - 0,0075 g/l; 4 - 0,01 g/l; 5 - 0,0125 г/л отварка от плодове на глог. (C) Криви: 1 - контролна проба; 2 - 0,001 g/l; 3 - 0,0015 g/l; 4 - 0,002 g/l; 5 - 0,0025 г/л отвара от шипки. (D) Криви: 1 - контролна проба; 2 - 0,001 g/l; 3 - 0,003 g/l; 4 - 0,004 g/l; 5 - 0,005 г/л запарка от малини.

в системата пероксидаза-луминол-водороден пероксид корелира със съдържанието на тритерпенови съединения. Въпреки това, в работата на същите автори, в която друго растение е обект на изследване, не се наблюдава корелация между TAU и съдържанието на която и да е група вещества, включително флавоноиди.

Тези несъответствия са свързани с поне три фактора. Първо, важна е активността на антиоксидантите, т.е. скоростта на тяхното взаимодействие с радикалите, която е различна за различните антиоксиданти, които съставляват растителната проба. Според Измайлов константите на скоростта на съответните реакции за мексидол, токоферол и кверцетин са свързани като 0,04: 2: 60. Второ, всяка антиоксидантна молекула, влизайки в химическа реакция, може да прихване различен брой радикали. Според работата, кверцетин, пикочна и аскорбинова киселини са задържали съответно 3,6 ± 0,1, 1,4 ± 0,1 и 0,5 ± 0,2 радикала на реагирала антиоксидантна молекула (използва се гемин-H202-луминол система). На трето място, резултатите от изследването биха могли да бъдат повлияни от наличието на пероксидазна активност в самите растителни проби, както и в работата, както и от наличието на калций в пробите, който, както е показано в работата, е в състояние да увеличи активността на пероксидазата от хрян при определени условия. Това обикновено води до повече

по-висок интензитет на CL на платото, отколкото на контролните криви, което обаче не наблюдавахме.

Първият фактор рязко ограничава използването на такъв параметър като промяна в светлинната сума, тъй като времето на измерване на хемилуминесценцията трябва да бъде по-дълго от времето на консумация на всички антиоксиданти в тестовата проба. Приближаването на този момент може да се прецени само чрез измерване на кинетиката на хемилуминесценцията. Освен това приносът на слабите антиоксиданти към ОАЕ е рязко подценен, тъй като времето на пълното им окисление е многократно по-дълго от приемливото време за измерване (10-20 минути).

Още по-голямо значение е стехиометричният коефициент на антиоксиданта. Броят на засечените от тях радикали n е равен на

където p е стехиометричният коефициент, а Am е промяната в концентрацията на антиоксиданта по време на измерването, в нашия случай първоначалната концентрация на тестваното вещество в тестовата проба.

Разликата в светлинната сума на луминесценцията при отсъствие на антиоксидант и в негово присъствие е пропорционална на n. Общият брой на прихванатите радикали е n = Y.p. м,

където е стехиометричният коефициент на даден антиоксидант, а m е неговата концентрация по време на промяната

Обект на изследване Флавоноиди, mg%* Танини, mg%* Аскорбинова киселина, mg%* AS/C ■ 10-8, arb. единици OAU, mg% кверцетин

Отвара от плодове на офика 8,87 ± 0,01 210,00 ± 10,00 0,67 ± 0,02 7,13 ± 0,96 56,53 ± 7,61

Отвара от шипки 4,66 ± 0,04 850,00 ± 20,00 3,70 ± 0,12 16,60 ± 3,40 131,63 ± 27,26

Отвара от плодове на глог 3,01 ± 0,06 12,00 ± 3,00 0,23 ± 0,002 3,18 ± 0,29 25,20 ± 2,32

Запарка от сушени малини 90,00 ± 4,00 40,00 ± 20,00 3,91 ± 0,08 6,65 ± 1,21 52,69 ± 9,56

Забележка: * - литературни данни, . AS - промяна в светлинната сума за пробата, отн. единици, C - концентрация на пробата в кюветата, g/l. Изчислените стойности са надеждни на p<0,05. Число измерений для каждого образца - четыре.

рений. Общият брой на прихванатите радикали очевидно не е равен на общото количество антиоксиданти, тъй като коефициентите pt не само не са равни на единица, но и се различават значително за различните антиоксиданти.

Стойността на n е пропорционална на разликата в светлинните суми, измерени за определено време между проба, съдържаща антиоксидант, и контролна проба, която не съдържа антиоксиданти:

където k е коефициент, който е постоянен при същите условия на измерване.

Разгледаният в статията метод позволява определяне на общия антиоксидантен капацитет, докато химичният анализ позволява да се определи общото съдържание на антиоксиданти в продукта. Следователно хемилуминесцентният метод изглежда е по-информативен от химичните анализи.

Условията, които избрахме за оценка на общия антиоксидантен капацитет на растителните суровини чрез записване на кинетиката на хемилуминесценция в система, състояща се от пероксидаза от хрян, водороден пероксид и луминол (концентрациите на компонентите са съответно 4 nM, 100 μM и 40 μM; 20 mM фосфатен буфер, pH 7,4),

осигурява окисляването на силни антиоксиданти (аскорбинова киселина) и умерени антиоксиданти (кверцетин) за 10 минути. Тази продължителност на измерване е удобна и осигурява необходимото качество на измерванията.

Анализът на кинетиката на хемилуминесценцията показа, че в изследваните обекти (отвари от офика, дива роза, плодове от глог и запарка от плодове от малина) основните антиоксиданти са средно силните антиоксиданти, включително флавоноидите, и слабосилните антиоксиданти (токоферол и др. ). Въз основа на намаляването на хемилуминесцентната светлинна сума е изчислен общият антиоксидантен капацитет за изследваните обекти. Сравнението на получените стойности на TAU с резултатите от химичния анализ показа, че продуктите, съдържащи едно и също количество антиоксиданти с различни съотношения, могат да се различават по способността си ефективно да защитават тялото от вредното въздействие на свободните радикали. Описаната техника е обещаваща за изследване на растителни обекти, съдържащи смес от различни антиоксиданти. В същото време се характеризира с простота и ниска цена на изследванията. Комбинирането на измерването на кинетиката на хемилуминесценцията с математическото моделиране на реакциите не само ще автоматизира процеса на определяне на TAU, но и ще определи приноса на отделните групи антиоксиданти към индикатора.

литература

1. Проскурнина Е. В., Владимиров Ю. А. Свободните радикали като участници в регулаторните и патологични процеси. В: Григориев А. И., Владимиров Ю. А., редактори. Фундаментални науки - медицина. Биофиз. пчелен мед. технология Москва: MAKS Press; 2015. т. 1. с. 38-71.

3. Хасанов В. В., Рижова Г. Л., Малцева Е. В. Методи за изследване на антиоксидантите. Chem. rast. сурови материали. 2004 г.; (3): 63-75.

4. Василиев Р. Ф., Кънчева В. Д., Федорова Г. Ф., Батовска Д. И., Трофимов А. В. Антиоксидантна активност на халконите. Хемилуминесцентно определяне на реактивността и квантово-химично изчисляване на енергии и структури на реагенти и междинни продукти. Кинетика и катализа. 2010 г.; 51(4): 533-41.

6. Федорова Г.Ф., Трофимов А.В., Васил Ев RF, Вепринцев Т.Л. Перокси-

радикално-медиирана хемилуминесценция: механично разнообразие и основи за антиоксидантен анализ. Аркивок. 2007 г.; 8:163-215.

8. Бастос EL, Romoff P, Eckert CR, Baader WJ. Оценка на антирадикален капацитет чрез H2O2-хемин-индуцирана луминол хемилуминесценция. J Agric Food Chem. 2003 г. 3 декември; 51 (25): 7481-8.

9. Владимиров Ю. А., Проскурнина Е. В. Свободни радикали и клетъчна хемилуминесценция. Успехи биол. хим. 2009 г.; 49:341-88.

10. Владимиров Ю. А., Проскурнина Е. В., Измайлов Д. Ю. Кинетичната хемилуминесценция като метод за изследване на реакциите на свободните радикали. Биофизика. 2011 г.; 56(6): 1081-90.

11. Измайлов Д. Ю., Демин Е. М., Владимиров Ю. А. Определяне на антиоксидантната активност чрез измерване на кинетиката на хемилуминесценция. Фотобиология и фотомедицина. 2011 г.; 7(2):70-6.

12. Lissi EA, Pascual C, Del Castillo MD. Луминесценция на луминол, индуцирана от 2,2"-азо-бис(2-амидинопропан) термолиза. Безплатно

Radic Res Commun. 1992 г.; 17(5): 299-311.

13. Lissi EA, Pascual C, Del Castillo MD. Относно използването на гасене на луминесценцията на луминол за оценка на активността на SOD. Free Radic Biol Med. 1994 юни; 16(6): 833-7.

15. Lissi EA, Salim-Hanna M, Pascual C, Del Castillo MD. Оценка на общия антиоксидантен потенциал (TRAP) и общата антиоксидантна реактивност от измервания на хемилуминесценция, усилена с луминол. Free Radic Biol Med. февруари 1995 г.; 18(2):153-8.

17. Cormier MJ, Prichard PM. Изследване на механизма на луминесцентна пероксидация на луминол чрез техники със спрян поток. J Biol Chem. 1968 25 септември; 243(18): 4706-14.

21. Алексеев А. В., Проскурнина Е. В., Владимиров Ю. А. Определяне на антиоксиданти чрез активирана хемилуминесценция с помощта на 2,2'-азо-бис(2-амидинопропан). Бюлетин на Московския държавен университет. Сер. 2. Хим. 2012; 53 ( 3): 187-93.

24. Министерство на здравеопазването на СССР Държавна фармакопея на СССР XI изд. Проблем. 2 „Общи методи за анализ. Лечебни растителни материали". М.: Медицина; 1987. с. 147-8.

25. Сергунова Е. В., Сорокина А. А., Корнюшина М. А. Изследване на препарати от екстракт от шипка. Аптека. 2012 г.; (2): 14-6.

26. Сергунова Е. В., Сорокина А. А., Аврач А. С. Изследване на плодовете от глог при различни начини на консервиране и извличане на вода. Аптека. 2010 г.; (5): 16-8.

27. Аврач А. С., Сергунова Е. В., Куксова Я. В. Биологично активни вещества от плодове и водни екстракти от обикновена малина. Аптека. 2014 г.; (1): 8-10.

28. Avrach A. S., Samylina I. A., Sergunova E.V. Изследване на биологично активните вещества от плодовете на глог - суровини за приготвяне на хомеопатични матриксни тинктури. в сб. научен tr. По материали на XXIV Моск. междун. хомеопат. конф. „Развитие на хомеопатичния метод в съвременната медицина”; 24-25 януари 2014 г.; Москва. М.; 2014. с. 146-7.

29. Сергунова Е. В., Сорокина А. А. Изследване на състава на биологично активните вещества в лечебните растителни материали с различни методи на съхранение. в сб. резюмета на базата на XX Рос. нац. конгр. „Човекът и лекарството”; 15-19 април 2013 г.; Москва. Москва: ЕкоОнис; 2013. с. 184-90.

30. Александрова Е. Ю., Орлова М. А., Нейман П. Л. Изследване на пероксидазната активност в екстракти от коренища и корени на хрян и неговата устойчивост на различни влияния. Вестн. Московски държавен университет. Сер. 2. Хим. 2006 г.; 47(5):350-2.

1. Проскурнина Е.В., Владимиров Ю.А. Безплатни радикални как участници регулаторни и патологични процеси. В: Григор "ев А.И., Владимиров Ю.А., редактори. Фундаментални" nye nauki - meditsine. Биофизически медицински технологии. Москва: MAKS Press; 2015.v. 1. стр. 38-71. Руски.

2. Chanda S, Dave R. In vitro модели за оценка на антиоксидантната активност и някои лечебни растения, притежаващи антиоксидантни свойства: преглед. Afr J Microbiol Res. декември 2009 г.; 3(13): 981-96.

3. Хасанов В.В., Рижова Г.Л., Малцева Е.В. Методи изследване на антиоксидантов. Химия Растител "ного Сыр" я. 2004; (3): 63-75. Руски.

4. Васил "ев RF, K" "ncheva VD, Fedorova GF, B" "tovska DI, Trofimov AV. Antioksidantnaya aktivnost" khalkonov. Хемилюминестентное определение реакционни способности и квантово-химически расчет на енергията и строежа на реагентите и интермедиатов. Кинетика и катализа. 2010 г.; 51(4): 533-41. Руски.

5. Славова-Казакова А.К., Ангелова С.Е., Вепринцев Т.Л., Денев П., Фабри Д., Деттори М.А. и др. Антиоксидантният потенциал на съединения, свързани с куркумина, проучен чрез кинетика на хемилуминесценция, ефективност на разкъсване на веригата, активност на поглъщане (ORAC) и DFT изчисления. Beilstein J Org Chem. 2015 11 август; 11:1398-411.

6. Федорова Г. Ф., Трофимов А. В., Васильев Р. Ф., Вепринцев Т. Л. Перокси-радикално-медиирана хемилуминесценция: механистично разнообразие и основи за антиоксидантен анализ. Аркивоц, 2007, 8: 163-215.

7. Федорова Г. Ф., Меншов В. А., Трофимов А. В., Васильев Р. Ф. Лесен хемилуминесцентен анализ за антиоксидантни свойства на растителните липиди: основи и илюстративни примери Анализатор 2009 Окт, 134 (10): 2128-34.

8. Бастос EL, Romoff P, Eckert CR, Baader WJ. Оценка на антирадикален капацитет чрез H2O2-хемин-индуциран луминол

9. Владимиров Ю.А., Проскурнина Е.В. Безплатни радикали и клеточная химиюминесценция. Usp Biol Khim. 2009 г.; 49:341-88. Руски.

10. Владимиров Ю.А., Проскурнина Е.В., Измайлов Д.Ю. Kineticheskaya khemilyuminestentsiya като метод изучения реакции свободных радикалов. биофизика. 2011 г.; 56(6): 1081-90. Руски.

11. Измайлов ДЮ, Демин Е.М., Владимиров Ю.А. Определение активности на антиоксиданти методом измерение кинетики хемилюминестсен-ции. Фотобиология и фотомедицина. 2011 г.; 7(2):70-6. Руски.

12. Lissi EA, Pascual C, Del Castillo MD. Луминесценция на луминол, индуцирана от 2.2"-азо-бис(2-амидинопропан) термолиза. Free Radic Res Commun. 1992; 17 (5): 299-311.

14. Lissi EA, Escobar J, Pascual C, Del Castillo MD, Schmitt TH, Di Mascio P. Видима хемилуминесценция, свързана с реакцията между метхемоглобин или оксихемоглобин с водороден пероксид. Photochem Photobiol. ноември 1994 г.; 60(5):405-11.

16. Landi-Librandi AP, de Oliveira CA, Azzolini AE, Kabeya LM, Del Ciampo JO, Bentley MV и др. In vitro оценка на антиоксидантната активност на липозомните флавоноли от системата HRP-H2O2-луминол. J Микрокапсул. 2011 г.; 28(4):258-67.

17. Cormier MJ, Prichard PM. Изследване на механизма

на луминесцентна пероксидация на луминол чрез техники със спрян поток. J Biol Chem. 1968 25 септември; 243(18): 4706-14.

18. Chang CL, Lin CS, Lai GH. Фитохимични характеристики, дейности за отстраняване на свободните радикали и неврозащита на пет екстракта от лечебни растения. Алтернативно допълнение, базирано на Evid. 2012 г.; 2012: 984295. DOI: 10.1155/2012/984295. Epub 2011 г. 10 август.

19. Chang CL, Lin CS. Фитохимичен състав, антиоксидантна активност и невропротективен ефект на екстрактите от Terminalia chebula Retzius. Алтернативно допълнение, базирано на Evid. 2012 г.; 2012: 125247. DOI: 10.1155/2012/125247. Epub 2011 5 юли.

20. Georgetti SR, Casagrande R, Di Mambro VM, Azzolini AE, Fonseca MJ. Оценка на антиоксидантната активност на различни флавоноиди по хемилуминесцентен метод. AAPS PharmSci. 2003 г.; 5(2):111-5.

21. Алексеев А.В., Проскурнина Е.В., Владимиров Ю.А. Opredelenie antioksidantov metodom aktivirovannoi khemilyuminestsentsii s ispol "zovaniem 2.2" -azo-bis (2-amidinopropana). Бюлетин по химия на Московския университет. 2012 г.; 53(3): 187-93. Руски.

22. Погачник Л, Улрих Н.П. Приложение на оптимизиран хемилуминесцентен анализ за определяне на антиоксидантния капацитет на билковите екстракти. Луминесценция. 2012 г. ноември-декември; 27(6):505-10.

23. Saleh L, Plieth C. Общо нискомолекулни антиоксиданти като обобщен параметър, количествено определени в биологични проби чрез анализ за инхибиране на хемилуминесценция. Nat протокол. 2010 септември; 5(10): 1627-34.

24. Министерство здравеопазване на СССР. Gosudarsvennaya farmakopeya SSSR. 11-то изд. бр. 2. „Общи методи анализ.

Лекарственное растительное "ное сыр" е", М.: Медльцина, 1987, с. 147-8. Руски.

25. Сергунова Е.В., Сорокина А.А., Корнюшина М.А. Изучение екстракционните препарати на шиповника. Аптека. 2012 г.; (2): 14-6. Руски.

26. Сергунова Е.В., Сорокина А.А., Аврач А.С. Изучение плодов бояришника различних способов консервации и водных извлечений. Фармация. 2010 г.; (5): 16-8. Руски.

27. Аврач А.С., Сергунова Е.В., Куксова Я.В. Biologicheski aktivnye veshchestva plodov i vodnykh izvlechenii maliny obyknovennoi. Фармация. 2014 г.; (1): 8-10. Руски.

28. Avrach AS, Samylina IA, Sergunova EV. Изучение биологически активных вещей плодов бояришника - сър "я для приготовления настоек гомеопатических матричних. Сборник доклади от 14-та Московска международна хомеопатична конференция "Развитие гомеопатического метода в современната медицина"; 24 янв.

29. Сергунова Е.В., Сорокина А.А. Изучение състава на биологични активни вещества в лекарствения растител "ном сир" и различни способи на консервация. Сборник на 20-ия руски национален конгрес "Человек и лекарство"; 2013 април 1519 г.; Москва. Москва: EkOOnis; 2013. с. 184-90. Руски.

30. Александрова Е.Ю., Орлова М.А., Нейман ПЛ. Изучение пероксидазной активности в екстракта из корневища и корней хрена и ее стабилност към различни въздействия. Химически бюлетин на Московския университет. 2006; 47 (5): 350-2. Руски език.

1 Болшакова Л.С. единМилентиев В.Н. 2Санников Д.П. 3Казмин В.М. 2

1 Орловски държавен институт по икономика и търговия

2 Федерална държавна бюджетна институция "Център за химизация и селскостопанска радиология "Орловски"

Библиографска връзка

Паничкин А.В., Болшакова Л.С., Милентиев В.Н., Санников Д.П., Казмин В.М. ИЗПОЛЗВАНЕ НА ХИМИЛУМИНЕСЦЕНЦИЯ ЗА ОЦЕНКА НА АНТИОКСИДАНТНИ СВОЙСТВА НА ХРАНИТЕЛНИ ВЕЩЕСТВА // Рационално хранене, хранителни добавки и биостимуланти. - 2014. - No 6. - С. 36-37;
URL: http://journal-nutrition.ru/ru/article/view?id=283 (дата на достъп: 17.12.2019 г.). Предлагаме на вашето внимание списанията, издавани от издателство "Академия по естествена история"